In Vitro і in vivo ефекти трьох різних екстрактів листя кратома на метаболизацию медикаментів II фази

Ферменти-глютатион трансферази (GST)

Анотація: у цьому дослідженні ми вивчаємо ефекти трьох різних екстрактів кратома: метанольні, водні та загальні алкалоїдні екстракти, на глутатіон трансферазной питомої активності в цитозолі печінки щурів Спрег-Доулі методами in vitro і in vivo. У дослідженні in vitro ефект екстрактів кратома (від 0,01 до 750 мкг / мл) проти питомої активність глутатіон трансфераз був досліджений в цитозольних фракції печінки необроблених щурів. Наші дані показують залежне від концентрації інгібування цитозольних GST після додавання екстракту кратома в реакційну суміш. При найвищої концентрації, метанольний екстракт показав найвищу питому активність GST інгібування (61%), а потім водний (50%) і загальний алкалоїдний екстракт (43%), відповідно. У дослідженні in vivo, на протязі 14 днів перорально використовували три різних дозування: 50, 100 і 200 мг / кг для метанольного і водного екстрактів, і 5, 10 і 20 мг / кг для загального алкалоідного екстракту. Зазвичай спостерігалося збільшення питомої активності GST. Однак, тільки водний екстракт кратома дозуванням 100 мг / кг показав значні результати: 129% в порівнянні з контрольною групою.

1. Введення

Крат (M. speciosa) зустрічається в тропічних і субтропічних регіонах Азії і належить до сімейства Rubiaceae. Листя кратома часто використовуються для лікування діареї або кишкових інфекцій, викликаних амебою і найпростішими одноклітинними організмами. Існує зведення про те, що листям кратома зловживали через звикання, яке викликають його властивості. Було виявлено, що індольного алкалоїд, мітрагінін, будучи основним компонентом M. Speciosa, залишає і, як вважають, є джерелом фармакологічних ефектів рослини. Наша недавня робота показала, що екстракт листя M. speciosa має антиоксидантну і протимікробну активність. Ці фармакологічні дії часто приписуються алкалоїдів, виявленим в листі. Однак, твердження про його безпечне використання в народній медицині не мають наукових підтверджень. Поглиблене дослідження взаємодії між травами і ферментами, метаболізується лікарські засоби, має важливе значення для подальшого визначення його використання в різних традиційних лікарських препаратах. Трансплантати глутатіону, GST (EC 2.5.1.18) є багатофункціональними ферменти, здатні каталізувати реакцію кон’югації між глутатионом (GSH) і електрофільними сполуками. Ці димерні ферменти знаходяться в клітці в різних життєвих формах і в основному беруть участь в детоксикації токсичних і канцерогенних сполук в клітинах, тим самим захищаючи їх від токсичних пошкоджень. Більш того, GST також діють як антиоксидантні ферменти через їх селен-незалежної активності пероксидази GSH. Кількість GST в печінці людини становить близько 4-10% від загальної кількості розчинних білків. Через їх великої кількості в клітці і широкої субстратної специфічності, слід очікувати взаємодії GSTs з новими представленими їм сполуками. Крім того, раніше були показані дії GST, модульованих рослинними продуктами. Метою цього дослідження було вивчення впливу метанольного, водного і загального алкалоідного екстрактів кратома на специфічну активність GSTs in vitro і in vivo у самців щурів Спрег-Доулі.

2. Результати та обговорення

Це перше і єдине дослідження про вплив екстрактів M. speciosa на повсюдно виявлені метаболизирующие ліки і антиоксидантні ферменти, глутатіонтрансферази (GST). У цьому дослідженні були оцінені три різних екстракту M. speciosa, а саме метанольний, водний і загальний алкалоїдний, для їх впливу на GST. Більшість зловживають M. speciosa в Малайзії споживають водний екстракт, шляхом кип’ятіння його в гарячій воді. Зокрема, при приготуванні водних екстрактів може спостерігатися деяке погіршення, але на всіх цих екстрактах не проводилося ретельного дослідження. Однак це не вважалося критичним, оскільки ми розглядаємо традиційний метод приготування і споживання M. speciosa. Звичайна реакція, що каталізується GST, являє собою утворення тіоефіру між GSH і електрофільним субстратом. Реакцію можна проілюструвати з використанням зондового субстрату 1-хлор-2,4-динітробензолу (CDNB), який може реагувати ферментативно або неферментативно з нуклеофилами. Отже, кінетику освіти тіоефіру можна контролювати з плином часу, і активність може бути розрахована. Результати нашого дослідження in vitro показують, що додавання екстрактів M. speciosa в реакційне середовище призводить до залежному від концентрації ингибированию цитозольних GST в чоловічій щура Спрег-Доулі in vitro. Відсоток інгібування специфічної активності GST варіювався від 3-61% для метанольного екстракту, 16-50% для водного екстракту і 15-43% для загального алкалоідного екстракту. Значення IC50 розраховували шляхом побудови процентного інгібування специфічної активності GST у порівнянні з логарифмічною концентрацією екстрактів M. speciose. Аналіз проводився з використанням GraphPad Prism® 5 (версія 5.01, GraphPad Software, Inc., США). Однак значення IC50 для всіх екстрактів щодо GST були більше, ніж найвища концентрація (750 мкг / мл). Для цих екстрактів точне IC50 не може бути визначено, оскільки максимальне інгібування (> 70% інгібування) не відбувається при більш високих дозах. Повідомлялося, що фенольні сполуки рослин, такі як дубильні кислота, еллаговая кислота, феруловая кислота, кавова кислота, силібін, кверцетин, куркумін і хлорогенова кислота, відповідальні за інгібування GST in vitro. У нашому дослідженні in vitro ми використовували дубильну кислоту в якості позитивного контролю. Танінова кислота показала 50% інгібування специфічної активності GST в концентрації 1,83 мкг / мл або 1,08 мкМ (дані не показані). Це значення співпало з попереднім повідомленням IC50 1,78 мкг / мл або 1,04 мкМ. Однак не всі рослинні феноли, такі як галова кислота і меллітовая кислота, можуть пригнічувати специфічну активність GST. Було висловлено припущення, що присутність полігідроксілірованія в рослинних поліфенолів має важливе значення для інгібування GST. Крім того, показано, що флавоноїди інгібують GST-активність в тромбоцитах крові людини, щурячої печінці та нирках щурів. У нашій недавній публікації повідомлялося, що екстракти листя M. speciosa мають антиоксидантну та антимікробну активність. Наші опубліковані дані показали, що екстракти M. speciose містять велику кількість загального фенольного змісту: метанол (105,6 мг еквівалента галової кислоти / г екстракт)> загальний алкалоїд (88,4 мг еквівалента галової кислоти / г екстракт)> водний (66, 0 мг еквівалента галової кислоти / г екстракту). З іншого боку, загальний вміст флавоноїдів є найвищим в метанольна (91,1 мг екстракт катехинового еквівалента / г екстракт), а потім водному (28,2 мг еквівалента катехина / г екстракт) і загальному алкалоїдний екстракті (20,0 мг еквівалента катехина / г екстракт). Хоча загальний алкалоїдний екстракт показує більшу кількість загального фенольного змісту, ніж водний екстракт, він показує менше загального змісту флавоноїдів. Це вказує на те, що крім флавоноїдів є інші фенольні сполуки, присутні в загальному алкалоїдний екстракті. Таким чином, наші дані показують, що флавоноїди є основною групою сполук, яка проявляє інгібування GST in vitro. Однак екстраполяція даних на людей вимагає ретельного вивчення, оскільки ізоферменти печінки GST, як відомо, більш чутливі до пригнічення рослинними фенолами, ніж ізоферменти людини. У дослідженні in vivo вживання експериментальними тваринами трьох екстрактів M. speciosa за 14 днів до їх смерті не показало значної різниці у відносній масі печінки і масі тіла. У нашому попередньому дослідженні токсичності ми спостерігали смерть щурів після вживання загального алкалоідного екстракту 200 мг / кг. Тому ми використовували дозу 20 мг / кг загального алкалоідного екстракту для годування щурів. Аналогічну дозу для загального алкалоідного екстракту використовували Reanmongkol et al. в їх дослідженні. Наше дослідження in vivo з використанням трьох доз – низька, середня і висока доза, показує суперечливі результати, в яких спостерігається загальне збільшення питомої активності в порівнянні з контрольною групою. Крім того, тільки цитозольні GST печінки щура з щури, обробленої водним екстрактом 100 мг / кг, показали значну індукцію при p <0,05 (129% питомої активності GSTs в порівнянні з контролем). Розбіжності між результатами in vitro і in vivo були описані в іншому місці для антиоксиданту, такого як еллагіновая кислота і куркумін, які є інгібіторами in vitro, але in vivo індукторами GSTs. Індукція може бути пов’язана з наявністю з’єднань, які збільшують експресію GST in vivo, яка не відбувається in vitro. Екстракти рослин і взаємодія GST повідомлялося раніше. Індукція GST in vivo потенційно вигідна для захисту клітин від негативного електрофільного впливу. Електрофільні з’єднання недостатні в парних електронах і можуть призводити до деяких захворювань, включаючи ракові і нейродегенеративні розлади, вириваючи електрони з макромолекул, таких як ДНК, білки та ліпіди. Індукція GST може привести до посилення захисту від токсичного впливу електрофільних хімічних речовин або метаболітів. Крім того, GST також захищають клітини шляхом секвестрації з’єднань за рахунок здатності зв’язувати більшість неполярних і гідрофобних молекул некаталітичні (функція лигандин). Їх зв’язування може пригнічувати каталітичну функцію GST. Однак деякі препарати біоактівіруются каталітичним шляхом GST і стають більш токсичними. Більш того, надекспресія GST пов’язана з резистентністю до алкилирующим протипухлинних препаратів через здатність пухлинних клітин стимулювати кон’югацію GSH, каталізується GSTs. З іншого боку, потенційно небезпечний результат може виникнути, якщо GST-опосередкована очищення електрофільних ксенобіотиків відзначено зниження через зниження захисту від електрофільних хімічних речовин або метаболітів.

3. Експериментальна частина
3.1. хімічні препарати

Всі використовувані реагенти були аналітичного класу. 1-Хлор-2,4-динітробензол (CDNB), відновлена ​​форма глутатіону (GSH), пентагідрат сульфату міді, фенол-реагент Фолина, змішаний виннокислий калій-натрій і карбонат натрію були отримані від Sigma Chemicals Co., Ltd. (Сент-Луїс, МО, США). Пропіленгліколь (пропан-1,2-діол) і полісорбат-80 (Твін-80) були придбані у Fisher Scientific (Loughborough, UK). Ортофосфат калію було отримано від Ajax Chemicals (Новий Південний Уельс, Австралія). Дікалій гідрофосфат був отриманий з Riedel-de Haen (Зельце, Німеччина). Дубильна кислота була отримана від R & M Chemicals (Канада). Хлорид калію було отримано від BDH Chemicals Ltd (Пул, Англія).

3.2. колекція рослин

Свіже листя M. speciosa були отримані з Кедах, Малайзія. Заводи були підтверджені компетентним ботаніком в Гербарії Школи біологічних наук, Universiti Sains Malaysia. Номер зразка ваучера на заводі – UKMB06509. Листя очищали і сушили в духовці при 40 ° С протягом трьох днів. Нарешті, висушене листя подрібнювали для отримання порошкоподібної форми.

3.3. Підготовка рослинних екстрактів

3.3.1. екстракт метанолу

Порошок M. speciosa leaf (100 г) був Soxhlet, екстрагований з використанням метанолу AR, до тих пір, поки зразок в наперстку не став безбарвним. Після цього метанол видаляли роторним випарником з отриманням 20 г неочищеного метанольного екстракту і зберігали при -20 ° С.

3.3.2. Водний екстракт

Висушена листової порошок M. speciosa (5 кг) кип’ятили у воді (8 л) протягом 2 годин. Зливали воду, і залишок кип’ятили вдруге при тих же умовах. Нарешті екстракт висушували до повністю сухого стану з отриманням 375 г екстракту, який зберігали при -20 ° С.

3.3.3. Загальний екстракт алкалоїдів

Сушені та порошкоподібні листя M. speciosa (5 кг) просочували метанолом протягом декількох днів при кімнатній температурі. Суспензію фільтрували і метанол видаляли роторним випарником з отриманням неочищеного метанольного екстракту. Процедуру екстракції і випарювання повторювали три рази. Потім 1 частина метанольного екстракту змішували з 35 частинами 90% оцтової кислоти. Суспензію фільтрували і фільтрат промивали петролейним ефіром. Кислотний шар подщелачивают карбонатом натрію до рН 9 і кілька разів екстрагують хлороформом. Об’єднаний хлороформний екстракт сушать над сульфатом натрію і випаровують, одержуючи 5 г (0,5% вихід) сирої суміші алкалоїдів.

3.4. стандартизовані екстракти

Всі екстракти листя M. specioasa були стандартизовані по відношенню до змісту його біоактивного з’єднання мітрагінін з використанням валідованого методу аналізу HPLC. Кількість мітрагінін в метанольних, водних і тотальних алкалоїдних екстрактах становило 6,0-8,0%, 0,1-0,5% і 22,0-24,0% відповідно. Стандартизовані екстракти метанолу, води і загального алкалоідного листа використовували для дослідження in vitro і in vivo.

3.5. тварини

Самців щурів Спрег-Доулі (150-200 г) отримували з Будинку тварин Universiti Sains Малайзії (USM). Щурів витримували при контрольованій температурі (25 ± 2 ° С), 12 ч світлих / 12 ч темних умовах протягом одного тижня перед початком експериментів. Вони були забезпечені водою і їжею ad libitium. Тварин утримували і обробляли відповідно до рекомендацій Етичного комітету USM, який схвалив вид експериментів.

3.6. Дослідження in vitro

Десять щурів були отримані і залишилися необробленими. Щурів вбивали цервікальної дислокацією. Печінка виймали для підготовки цитозольних фракції, як описано в розділі 3.7.

3.7. Підготовка цитозольних фракції печінки щурів

Щурячу печінку видаляли відразу ж після того, як жертву промивали, охолодженої льодом, дистильованою водою. Після чого використовували так само, охолоджений льодом, 67 мМ калій-фосфатний буфер (рН 7,4), промокали сухим і зважували. Ізольовані зразки яєць щурів гомогенізували в 3 обсягах 67 мМ калій-фосфатного буфера (рН 7,4), що містить 1,15% хлориду калію, з використанням гомогенізатора Potter-Elvehjem. Після центрифугування гомогенатной фракції при 12 500 × g протягом 20 хвилин при 4 ° С отриманий супернатант декантировали в ультрацентріфужние пробірки (OptisealTM) і центрифугували при 100000 × g протягом 60 хвилин в холодильній ультрацентрифуге OptimaTM TLX (Beckman Coulter, Inc., США) . Отриманий супернатант був цитозольні фракцію. Концентрація білка визначалася методом Лоурі. Цитозольні фракції зберігали при -80 ° С до використання.

3.8. Дослідження In Vivo

Щурів випадковим чином ділили на 10 груп по 6 тварин на кожну групу. Використовували три різні дози: 50 мг / кг, 100 мг / кг і 200 мг / кг. Доза для загального алкалоідного екстракту становить одну десяту від використовуваної дози. Листи з метанолу, води і загального алкалоідного розчину розчиняли в розчині співрозчинники (пропіленгліколь-Твін 80-вода = 4: 1: 4) і вводили перорально в постійному обсязі 5 мл / кг. Групою 1 була контрольною (отриманий співрозчинники); групи 2, 3 і 4 отримували метанольний екстракт (50, 100 і 200 мг / кг відповідно). Групи 5, 6 і 7 отримували водний екстракт (50, 100 і 200 мг / кг відповідно). Групи 8, 9 і 10 отримували загальний алкалоїдний екстракт (5, 10 і 20 мг / кг відповідно). Всі процедури вводилися перорально через шлунковий зонд протягом 14 послідовних днів. Після закінчення лікування тварин умертвляли за допомогою цервікальної дислокації, і печінку збирали для підготовки цитозольних фракції.

3.9. Аналізи інгібування GST

Пригнічення активності цитозольних GST за допомогою рослинних екстрактів оцінювали, як описано раніше Хабігом, з невеликими змінами. GST-опосередковане кон’югування 1-хлор-2,4-динітробензолу (CDNB) з глутатионом (GSH) вимірювали з використанням пластинчастого планшета PlateCHAMELEONTM, 425-106 (Hidex Oy, Фінляндія) на довжині хвилі 340 нм протягом 5 хвилин. Інкубаційні суміші (300 мкл) містили 0,1 М фосфатного буфера калію pH 6,5, 30 мМ CDNB, 30 мМ GSH і GST ферменти (0,125 мг / мл цитозольних фракції печінки щурів). Рослинні екстракти розчиняли в дистильованої воді, відчували в діапазоні концентрацій 0,01-750 мкг / мл. Таніческіх кислоту використовували в якості позитивного контролю для дослідження in vitro в діапазоні концентрацій 0,3-10 мкг / мл. Для дослідження in vivo цитозольні фракції від оброблених щурів використовували без додавання рослинних екстрактів до реакційної суміші. Всі аналізи були лінійними функціями концентрації білка і часу протягом як мінімум 5 хвилин. Активність ферментів виражалася як процентна питома активність в порівнянні з контролем.

3.10. Статистичний аналіз

Всі значення виражаються як середнє ± стандартне відхилення (SD) п’яти зразків. ANOVA з наступним тестом Dunnet використовувалася для оцінки відмінностей у важливості отриманих результатів. Всі обчислення були виконані з використанням GraphPad Prism® 5 для програмного забезпечення Windows (версія 5.01, GraphPad Software, Inc., США).

Висновки

На закінчення, згідно з нашими даними, екстракти M. speciosa показують як в дослідженнях in vivo, так і in vitro значущі траво-лікарські взаємодії. Однак, інгібування GST in vitro дуже незначно, оскільки IC50 значення для всіх трьох екстрактів більше, ніж найвища концентрація (750 мкг / мл). У дослідженні in vivo, тільки водний екстракт M. speciosa в дозі 100 мг / кг показує значну індукцію, хоча всі інші екстракти в різних дозах показують загальне збільшення питомої активності GST. Вивчення індуктивного ефекту у щурів за допомогою дослідження in vivo не обов’язково відображає те, що може статися в людині in vivo. Тому подальші дослідження необхідні для дослідження клінічного відповідності екстрактів M. speciosa-GSTs в тілі людини.

https://d3n8a8pro7vhmx.cloudfront.net/americankratomassociation/pages/21/attachments/original/1443496310/In_Vitro.pdf?1443496310